16S+代謝組學(xué)聯(lián)用常見問題一攬子告訴你答案
2023-01-12 閱讀數(shù)：5527
微生物16S分析鑒定了樣本中微生物的種類和可能具有的功能，但是微生物真的有這樣的功能嗎？怎么能快速準確地做出鑒定呢？那就來試試16S+代謝組學(xué)聯(lián)用的方法吧。
組學(xué)聯(lián)用，一個鑒定微生物種類，一個鑒定微生物功能，還能發(fā)高分文章，why not？
1、16S是什么？
16S rDNA是指細菌基因組中編碼核糖體16S rRNA分子所對應(yīng)的DNA序列，序列全長約1540bp，包含10個保守區(qū)和9個高變區(qū)（V1-V9）。保守區(qū)序列在細菌間差異不大而高變區(qū)則具有種屬特異性，因此最常用作細菌分類標(biāo)準。通過對環(huán)境樣品的細菌總DNA進行提取，擴增其中16S rDNA基因，可以鑒定出絕大多數(shù)細菌類別。
2、代謝組學(xué)是什么？
代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的新興的組學(xué)技術(shù)，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其對生物體內(nèi)所有小分子代謝物進行定性定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究方式，其研究對象大都是分子量1500以內(nèi)的小分子物質(zhì)。
3、為什么要選擇做16S+代謝組學(xué)？
16S只是研究了腸道微生物的構(gòu)成和組份的改變與宿主的生理以及人類的疾病相關(guān)。然而，腸道微生物對宿主的作用其中一方面貢獻是通過腸道中微生物產(chǎn)生的小分子次級代謝產(chǎn)物，通過循環(huán)系統(tǒng)來作用于人體的各個部位，調(diào)控宿主體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，比如許多研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物的代謝產(chǎn)物對糖尿病、高血壓、心臟病和抑郁、腸道的免疫等疾病都有影響。16S可以得到樣本當(dāng)中有哪些微生物，和預(yù)測他們的功能，而代謝組學(xué)研究代謝物的表達量、代謝物與生理病理變化的關(guān)系，能夠幫助確定這些功能是否真的發(fā)生了，發(fā)生的程度是什么樣的。兩者的聯(lián)用，可以通過代謝組結(jié)果的檢測輔助和驗證16S分析結(jié)果；兩者的聯(lián)合分析可以得到微生物多樣性、種類、相對豐度與代謝物豐度的關(guān)聯(lián)。
4、代謝組學(xué)與其他組學(xué)相比，有什么優(yōu)勢？
①基因和蛋白質(zhì)表達的微小變化會在代謝物水平得到放大；
②代謝組學(xué)的研究不需進行全基因組測序及建立大量表達序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫；
③代謝物種類遠少于基因和蛋白的數(shù)目，每個生物體中代謝產(chǎn)物大約在103數(shù)量級，而最小的細菌，其基因組中也有幾千個基因；
④生物體液的代謝物分析可反映機體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)。
5、與16S聯(lián)用時，如何選擇是用非靶標(biāo)代謝組還是高通量靶標(biāo)代謝組？
如果沒有特別關(guān)注的代謝物質(zhì)建議選擇非靶標(biāo)，可以檢測出某一特定條件下所有的代謝產(chǎn)物，并進行定性和相對定量分析，以尋找目標(biāo)差異代謝物；如果有關(guān)注的目標(biāo)代謝物建議選擇高通量靶標(biāo)代謝組，對特定的代謝物群進行有針對性的特異性檢測。
6、16S 與代謝組聯(lián)用時，一般檢測哪些樣品類型？樣本量需要多少？
代謝組與16S聯(lián)用時，16S的樣品主要是糞便和腸道內(nèi)容物；而代謝組的樣本主要是糞便、血漿或血清、尿液等（具體項目可以參考相應(yīng)的參考文獻）。
臨床標(biāo)本：每組100例（不少于30例，越多越好）
模式動物：每組12個樣品（不少于8個，越多越好）
注意：遵從“保持最鮮活的狀態(tài)”原則，通過低溫、淬滅的方法阻止離體后的代謝活動。樣品不能pooling，不能反復(fù)凍融；血清/血漿不能溶血；如果是用血漿，請用肝素鈉抗凝，EDTA抗凝效果不好。
7、代謝組為什么需要這么多生物學(xué)重復(fù)？
相較于基因和蛋白，代謝物處于生命活動的下游，動態(tài)波動性大。因此需要很多生物學(xué)重復(fù)來增加數(shù)據(jù)的可靠性和說服力。
8、代謝組和16S的樣品取樣時間可以不一致？
建議取樣時間一致。
若代謝組和16S樣本類型一樣，那么在收集樣品的時候可以多準備一份樣品，即一個樣分裝至少2兩管，一管用于16S，一管用于代謝組。
若代謝組和16S樣本類型不一樣，也應(yīng)該要保持一樣的取樣時間。
9、同一樣本的代謝組為什么不能分兩批檢測？
最好不要分成兩批檢測，因為這兩個時間點儀器的響應(yīng)會發(fā)生變化，這樣可能導(dǎo)致的問題是一些含量低的物質(zhì)可能只在一個批次里被檢出。
10、代謝組學(xué)我該選擇哪個平臺？
代謝組學(xué)的技術(shù)平臺主要分為NMR（核磁共振譜）、GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）、LC-MS（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）。
NMR的特點是樣品需求量小，前處理比較簡單，對于復(fù)雜的生物樣本比較合適；但對讀譜人員的要求高；靈敏度低，檢測動態(tài)范圍有限。
GC-MS和LC-MS的特點是結(jié)合了色譜良好的分離能力和質(zhì)譜的普適性、高靈敏度以及專一性，具體而言GC-MS分辨率、選擇性好，數(shù)據(jù)庫較為健全，但樣品處理過程繁瑣；LC-MS靈敏度、分辨率高，可以分析不穩(wěn)定、不易衍生化、難揮發(fā)和分子量大的代謝物，可對極性化合物有較好的檢測。但數(shù)據(jù)庫不健全，可鑒定的化合物有限。
因此在選擇平臺時應(yīng)結(jié)合自身樣本情況與個體需求，綜合考慮。
11、色譜質(zhì)譜串聯(lián)的優(yōu)勢是什么？
使用靈敏度更高、分辨率更高、定性能力更強的質(zhì)譜儀代替了光學(xué)檢測器。將色譜的分離能力和質(zhì)譜的分辨、定性能力強強聯(lián)合，可以對更多的物質(zhì)進行準確檢測。
12、與16S聯(lián)用時，代謝組檢測平臺一般選擇GC-MS，還是LC-MS？
兩種平臺都可以，因為檢測平臺是依據(jù)檢測的代謝物類型來推薦的，具體參考如下圖：
13、能區(qū)分哪一個是寄主的代謝產(chǎn)物，哪個是哪種微生物的代謝產(chǎn)物嗎？
通過腸道菌群非靶向代謝組學(xué)的自建數(shù)據(jù)庫，篩選出代謝物是微生物特有的，哪些是共有的，哪些是宿主的。
注：1166個腸道菌群特有的代謝物（其中884個有MS2譜圖），868個人菌共有的代謝物，366個人特有的代謝物，合計共2400個。
14、做了代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)沒有差異，該怎么辦？
如果沒有找到差異代謝物，那么還可以就檢測到的物質(zhì)進行KEGG Patheway分析，即對代謝物參與的代謝通路進行研究，觀察是否有其他的補給途徑、代謝途徑與疾病之間是否存在一定的關(guān)聯(lián)性。
15、代謝組檢測結(jié)果的物質(zhì)名稱都是英文的，我需要中文名稱怎么辦？
建議根據(jù)物質(zhì)的KEGG名稱和CAS號在“愛化學(xué)”（http://www.ichemistry.cn/）網(wǎng)站查詢中文名稱。
16、如何對差異代謝物做進一步的篩選？
一般是使用 P值<0.05 & VIP>1這樣的卡值來進行差異物的篩選。
P值來源單元變量統(tǒng)計分析，VIP值來源于多元變量統(tǒng)計分析（來源于 OPLS-DA模型）表征該變量對兩組差異的貢獻值，當(dāng)然VIP值越大對差異貢獻越大。
使用P值<0.05 & (FC>2或FC<0.5) [FC= Fold change]來進行差異物篩選也是有這樣的做法，但是P值和FC值都來源單元變量統(tǒng)計分析。推薦使用P值<0.05 & VIP>1的篩選方法。
在此基礎(chǔ)上要做進一步的篩選的話，有以下幾個方法：
1）P 值<0.05，對VIP值做排序（VIP值越大，差異代謝物越有意義）
2）VIP>1，對 P值做排序（P值越小，差異代謝物越有意義）
3）在 P 值<0.05 & VIP>1 的范圍內(nèi)，對FC值做排序（大于2的FC，越大越有意義；小于0.5的FC，越小越有意義）
限定更嚴格的基礎(chǔ)篩選條件，比如：P值<0.01 & VIP>2。重做以上三種方法。
高通量測序檢測中心
中心定位于科研服務(wù)與臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化應(yīng)用，圍繞基礎(chǔ)科研和臨床檢測兩大板塊，致力于生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的相關(guān)研究與測序大數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，為各大高校、醫(yī)院和科研單位提供醫(yī)學(xué)科研項目的方案設(shè)計、測序?qū)嶒灪蛿?shù)據(jù)分析為一體的一站式服務(wù)以及快速精準的臨床檢測服務(wù)，以成為業(yè)內(nèi)領(lǐng)先的高通量測序服務(wù)中心為目標(biāo)。
目前，我司高通量測序檢測中心擁有Illumina和MGI等高通量測序儀組成的大規(guī)模高通量測序服務(wù)平臺，科研服務(wù)可提供涵蓋基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（外泌體）、表觀組學(xué)、單細胞組學(xué)、微生物組學(xué)、免疫組庫、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)和多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析等組學(xué)基礎(chǔ)研究服務(wù)和高級生物信息分析；臨床服務(wù)包括遺傳性腎病基因檢測、血液腫瘤基因檢測、實體瘤基因檢測、感染性疾病病原體檢測等服務(wù)。
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